Стрептавидин Сигма ЦАС 9013-20-1

1. Упознајте стрептавидин
Стрептавидин (СА), излучени протеин који потиче од Стрептомицес авидинии, има молекулску тежину од приближно 65-66 кДа и изоелектричну тачку од око 6,0. То је тетрамерни протеин састављен од четири хомологне подјединице, од којих свака има независно место везивања за биотин – што значи да се један молекул стрептавидина може истовремено везати за четири молекула биотина. Константа дисоцијације (Кд) између њих је само око 10 ⁻¹⁵ М, што је једна од најјачих познатих нековалентних биолошких интеракција и може се сматрати најпрецизнијим „механизмом молекуларног закључавања“ у природи.

У поређењу са авидином добијеним од беланаца, има неупоредиве предности:

Не садржи модификације гликозилације, у целини је електрично неутралан, стога има изузетно ниско не-специфично везивање у физиолошким условима, чисту експерименталну позадину и одличан однос сигнала- према-шуму. Поред тога, његова одлична отпорност на денатурацију и разградњу протеазе, као и његова способност да издржи екстремне пХ вредности, високе температуре (70-80 степени Ц), органске раствараче и конвенционална денатуришућа средства (као што су СДС и уреа), заменили су авидин и постали неоспорни „златни стандард“ у системима за везивање биотина.

Управо са овим изванредним карактеристикама блиста у областима као што су науке о животу, ин витро дијагностика, скрининг лекова и биосенсинг.

2. Тестирање имунитета
Примена у области имунолошке детекције је њена најкласичнија и најшире коришћена примена. Од свог развоја касних 1970-их, биотин стрептавидин систем (БАС) је постао камен темељац имунолошког обележавања и анализе праћења због свог ултра-високог афинитета и ефекта каскадне амплификације. Према статистикама, око 85% уобичајених хемилуминисцентних анализатора користи методе детекције засноване на БАС-у, што указује на њихову доминантну позицију.

2.1 Ензимски имуносорбентни тест (ЕЛИСА)

У ЕЛИСА тесту, пероксидаза рена (ХРП) или алкална фосфатаза (АП) се могу спојити и ензим може бити прецизно вођен до циља преко биотинилованих антитела. ХРП катализира ТМБ, ДАБ или ЕЦЛ луминисцентне супстрате да би произвео моћне хемијске или оптичке сигнале, док АП катализира БЦИП/НБТ, ПНПП и друге супстрате да би произвео стабилне сигнале боје или хемилуминисценције. Биотиниловани циљни молекул може да се веже за вишеструко обележени стрептавидин, постижући више-појачавање сигнала и омогућавајући откривање циљева са малом заступљеношћу. Ова технологија се широко користи у сендвич и компетитивној ЕЛИСА тесту, покривајући сценарије као што су квантификација протеина, детекција антитела, скрининг патогена итд.

2.2 Имуноблотирање протеина (Вестерн блот)
У Вестерн Блоту, везивање са биотинилованим секундарним антителима може значајно повећати интензитет сигнала циљних протеина на трансферним филмовима. У поређењу са традиционалним секундарним системима антитела, БАС системи могу постићи јаче појачање сигнала због својих тетравалентних својстава везивања. Поред тога, због ниског не-специфичног везивања стрептавидина, позадинске интерференције су значајно смањене, што их чини посебно погодним за квантитативну анализу протеина мале количине.

2.3 Имунохистохемија (ИХЦ) и имуноцитохемија (ИЦЦ)
Стрептавидин обележен ХРП или АП је пожељна алатка за појачавање сигнала за ИХЦ и ИЦЦ. ХРП систем је погодан за експерименте који захтевају изузетно високу осетљивост детекције, док је АП систем посебно погодан за системе који садрже ХРП инхибиторе (као што је натријум-азид) или експерименталне сценарије који захтевају дуготрајан-развој боје и стабилност сигнала. Везивањем биотинилованих сонди или антитела за коњугате стрептавидина, циљни молекули се могу тачно лоцирати у деловима ткива или узорцима ћелија.

2.4 Имунофлуоресценција (ИФ) и ин ситу хибридизација (ИСХ)

Стрептавидин обележен флуоресцеином (као што је ФИТЦ Стрептавидин, ПЕ Стрептавидин, АПЦ Стрептавидин) је универзални алат за визуелизацију за имунофлуоресцентно бојење и ин ситу хибридизацију. ФИТЦ маркер има таласну дужину ексцитације/емисије од приближно 494/519 нм и показује светло зелену флуоресценцију; Таласна дужина ексцитације/емисије ПЕ маркера је око 565/578 нм, што је „златни стандард“ за анализу проточне цитометрије у више боја; АПЦ маркер покрива далеки црвени спектар, омогућавајући више-сликање у боји. Ови флуоресцентни маркери могу прецизно да се вежу за биотинилована антитела или сонде нуклеинске киселине да би се постигла анализа локализације и квантитативна детекција циљних молекула.

2.5 Проточна цитометрија (ФАЦС)

У проточној цитометрији, флуоресцентно обележен стрептавидин (посебно ПЕ обележен) се користи за откривање антигена на површини ћелије обележених биотинилованим антителима. Његова одлична осветљеност обезбеђује изузетно висок однос сигнал-на-шум, који може ефикасно да открије ћелијске популације са ниском експресијом површинског антигена или слабим сигналима. Неопходан је реагенс у анализи више-проточне цитометрије у боји.

2.6 Ензимски Иммуноспот тест (ЕЛИСПОТ)
Стрептавидин означен са АП показује одличне перформансе у ЕЛИСПОТ-у и погодан је за анализу чврсте{0}}фазе и системе бојења ткива/ћелија. Може стабилно да катализује производњу супстрата избројивих спот сигнала за детекцију лучења цитокина на нивоу једне-ћелије.

3. Пречишћавање протеина и нуклеинских киселина
3.1 Афинитетна хроматографија и пречишћавање протеина
Стрептомицин је основна компонента паковања афинитетне хроматографије. Након обележавања биотином протеина који треба да се пречисти, он се меша са стрептавидин агарозним гелом (као што је стрептавидин агароза/сефароза), а обележени протеин ће се уско везати за стрептавидин на пунилу. Испирањем да би се уклониле нечистоће, а затим прањем циљног протеина под одговарајућим условима (као што је кључање СДС-ПАГЕ пуфера, 0,1% СДС третман или 95% формамид+10 мМ ЕДТА третман на пХ 8,2), могу се добити производи високе -чистоће.

Узимајући за пример индустријску производњу рекомбинантног хуманог инсулина, високо-квалитетне магнетне куглице стрептавидина могу да вежу више од 1200 пмол слободног биотина по милиграму, а чистоћа пречишћеног протеина може да достигне преко 95%.

3.2 Имунопреципитација (ИП) и имунопреципитација хроматина (ЦхИП)
Примена стрептавидин магнетних перли у имунопреципитацији у великој мери побољшава експерименталну ефикасност. Истраживачи могу да фиксирају биотинилована антитела на магнетне перле стрептавидина и инкубирају их са ћелијским лизатом.

Антитела специфично хватају циљни протеин и његове протеине у интеракцији, формирајући комплекс "циљног протеина антитела магнетне куглице". Може се брзо одвојити под дејством спољашњег магнетног поља, уз једноставан рад и високу осетљивост. У ЦхИП експериментима, стрептавидин магнетне перле су такође коришћене за хватање биотинилованих ДНК протеинских комплекса и проучавање интеракције између протеина и ДНК.

3.3 Експеримент повуците надоле
У проучавању интеракција протеина{0}}протеина, магнетне перле могу да ухвате биотиниловане протеине мамаца, а затим да „пецају“ на препротеине који ступају у интеракцију са њима. На пример, када се проучавају кључни сигнални путеви у туморским ћелијама, специфична антитела која препознају протеин П53 се имобилишу на стрептавидин магнетним перлицама и ко-инкубирају са лизатом туморских ћелија како би се ефикасно обогатио П53 и повезани протеини. У поређењу са традиционалним методама имунопреципитације, ИП магнетне куглице има већу осетљивост и специфичност, и може ефикасније да обогати циљне протеине мале количине.

3.4 РНА Повуците-надоле
Магнетне перле су такође погодне за експерименте{0}}повлачења РНК. Након везивања са стрептавидин магнетним перлама, биотиниловане РНК сонде могу ухватити протеине који ступају у интеракцију са РНК из ћелијских лизата за проучавање мрежа интеракције РНК протеина.
3.5 Припрема једноланчане ДНК и екстракција нуклеинске киселине
Може се везати са биотинилованим олигонуклеотидима за припрему једноланчане ДНК и ефикасну екстракцију нуклеинских киселина, играјући важну улогу у молекуларном клонирању и генетском инжењерингу.

4. Висока пропусна детекција и скрининг лекова
4.1. ТР-Платформа за тестирање ФРЕТ
Може да се комбинује са луминисцентним хелатима као што су хелати европијума да би се извршило повезивање сигнала и молекуларно хватање у систему за детекцију ТР-ФРЕТ (временски-пренос енергије флуоресценције резонанце). На пример, ТХУНДЕР™ Стрептавидин обележен европијумом посебно дизајниран за експерименталну платформу ТР-ФРЕТ може стабилно да се веже за различите биотиниловане модификоване молекуле и широко се користи у анализи интеракције протеина и прелиминарном скринингу циљних лекова.

Овај систем је хомоген и високог{0}}пропуста, што га чини моћним алатом за савремени развој лекова.

4.2 Циљана испорука лекова
Његова својства везивања за биотин чине га идеалним носачем за системе за испоруку лека. Спајањем молекула лека са биотином и коришћењем циљане способности везивања стрептавидина, може се постићи прецизна испорука лека, побољшавајући ефикасност лечења и смањујући нежељене ефекте.

4.3 Биосензори и биочипови

То је основни материјал за производњу биосензора и биочипова. Имобилизацијом стрептавидина на површини чипа као елемента за хватање, биотином обележене протеинске сонде или антитела могу да се имобилишу на њему, постижући висок-пропусност и високу-осетљивост детекције. На пример, у раном скринингу протеинских чипова за кардиоваскуларне болести, магнетне куглице стрептавидина се фиксирају на супстрат чипа и користе за везивање биотинилованих протеинских сонди. Ово може прецизно открити абнормалности код пацијената у раним стадијумима болести и када су концентрације маркера у крви ниже од цТнИ од 0,01 нг/мЛ, што повећава дијагностички прозор за 2-3 сата у поређењу са традиционалним дијагностичким методама.

5. Биологија ћелије и сликање
5.1 Обележавање површине ћелије и флуоресцентно сортирање ћелија
Флуоресцентно обележени стрептавидин (као што је Вари Флуор 488 Стрептавидин) се широко користи за обележавање површине ћелије и флуоресцентно сортирање ћелија. Његов емисиони спектар покрива цео спектар видљиве и блиске-инфрацрвене светлости, а у експериментима обележавања у више-боја, лако може да уђе у језгро и цитоплазматску структуру, означи циљне протеине за снимање и анализу.

5.2 Нанотехнологија и самосастављање материјала
Својства тетравалентног везивања чине га идеалним „мостом“ за само{0}}састављање наноматеријала. Кроз циљано везивање биотин стрептавидина, могу се конструисати различите наноструктуре за интердисциплинарна истраживања као што су биолошко снимање и праћење животне средине.

6. Антитело против стрептавидина
Са широко распрострањеном употребом стрептавидин биотинског система, појавио се често занемарен проблем - ендогена анти-стрептавидин антитела (АСА) у узорку могу да ометају систем детекције. Истраживања су открила да везивање АСА за СА у реакционом систему може утицати на исправну конструкцију система специфичних антигенских антитела, што доводи до угрожене тачности спајања, детекције или дијагностичких резултата.

Да би се решио овај изазов, појавили су се комплети за детекцију антитела против стрептавидина, који се могу користити за откривање ендогене АСА у узорцима пацијената и избегавање њеног мешања са БАС системом. Роцхе Цустом Биотецх је развио неактивни мутант стрептавидина (Стрептавидин рец. инацтиве, поли), који се може додати тренутном систему без додатних корака за специфично блокирање и елиминисање АСА сметњи, побољшавајући тачност и специфичност система за детекцију.

7. Интерференција биотина
Иако је систем биотина стрептавидин моћан, суочава се са све озбиљнијим изазовом - интерференције биотина.

Када постоји висока концентрација слободног биотина у узорку за тестирање, он се такмичи са биотинилованим антителима за место везивања стрептавидина, што доводи до искривљених резултата детекције.

Орална примена 100 мг биотина може довести до максималне концентрације у плазми од 375-450 нг/мЛ; Пацијенти са мултиплом склерозом могу да узимају 300 мг/д орално, а нивои биотина у плазми могу да пређу 1000 нг/мЛ; Дневни унос од 500 мг биотина може довести до изузетно високих концентрација биотина у крви. У сендвич имунотестовима, прекомерна количина биотина може дати погрешне ниске резултате; У конкурентским имунолошким тестовима, то може довести до погрешних високих резултата.

Бројне студије су показале да су ТСХ, тироксин ПТХ, ендокрини тестови као што су адренокортикотропни хормон, пролактин, тестостерон, кортизол, као и туморски маркери и срчани функционални маркери, у различитом степену под утицајем биотина. ФДА је сукцесивно издавала информације упозорења и одговарајуће смернице. Стратегије суочавања укључују: серијско разблаживање узорака, прелазак на методе које нису БАС као што је течна хроматографија-масена спектрометрија, поновно тестирање након клиренса биотина (само 2 сата, све до 15 дана или чак месеци) или коришћење слободних хватача биотина.